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    解析CAR-T疗法相关问题

    * 作者 : admin * 发表时间 : 2018-03-29 * 浏览 :

    背景:癌症一直是困扰人类的巨大难题。虽然随着手术治疗、化疗、放疗等治疗方式的出现,癌症的生存率已经有了很大的改善,但是这些疗法对于解救全球上千万 的癌症患者是远远不够的。随着生物技术的飞速发展,生物治疗在这样紧迫的形式下应运而生,目前已成为癌症治疗领域的第四大疗法。

    (一)CAR-T疗法是如何发展起来的?


    早在1985年,由于认识到放化疗在肿瘤治疗上的局限性,美国NCI就推出了过继性细胞治疗的临床应用,简称ACT。但很快就发现在临床上这种ACT由于回输的免疫细胞缺乏肿瘤抗原特异性,也就是我们通常说的靶向性,因此没有在临床上起到期望的治疗效果。不 久后,1989年美国科学院院刊(PNAS)上出现了CAR的首次报道,即第一代CAR。当时的思路很简单,就是既然回输的免疫细胞没有靶向性,那么我们 就在T细胞表面去表达一个单链抗体基因,这个单链抗体表达后可以特异性识别肿瘤细胞表面的分子。第一代CAR就被很快投入临床试验,但是令人遗憾的是,第 一代CAR虽然能够看到一些特异性的细胞毒性,但2006年对其进行临床试验总结的时候却发现疗效差强人意。究其原因是因为第一代CAR-T细胞在病人体 内很快就会耗竭,其持久性(persistence)很差,以至于CAR-T细胞还没有来得及接触到大量的肿瘤细胞时就已经凋亡了。事 实上,第一代CAR的这种局限性更早的时候就被科学家们注意到了,因此1998年就出现了第二代CAR,其改进思路就是将T细胞完全活化和生存必须的第二 信号分子(一般是选择CD28或者CD137分子)也组装进CAR里面,这样的第二代CAR在随后的临床试验中产生了意想不到的效果,从2010年起基于 第二代CAR的临床报道屡次引发震动,特别是对于复发性、难治性的ALL病人,其完全缓解率高达90%以上。随后,为了进一步增强CAR-T细胞在体内的 存活,第三代CAR也出现了,就是在第二代CAR的基础上再增加一个第二信号分子,比如将CD28-CD137分子同时组装进CAR里面。

    (二)CAR-T疗法到底是什么?

    CAR-T 疗法是将患者T 淋巴细胞通过基因工程改造,使其表达肿瘤特异性的嵌合抗原受体(CAR)基因,被“重编码”的T 淋巴细胞在体外大量培养、扩增后回输患者,以主要组织相容性分子(MHC)非依赖地方式识别和杀伤肿瘤。科学家们注意到了,CAR-T细胞治疗技术具有鲜明的靶向性, 在病人体内可长期存在,并且不依赖于抗原递呈,因此具有彻底清除肿瘤细胞的潜力。例如IL-12,IL-12被誉为T淋巴细胞的第三信号分子,可见其对T细胞功能的重要性。系统注射IL-12给病 患会引起严重的炎症副反应,但是通过CAR-T细胞来实现局部表达后,可以在肿瘤病灶处招募NK细胞,或者直接逆转被耗竭的肿瘤浸润性T淋巴细胞,从而有 效克服肿瘤免疫抑制微环境。CAR-T疗法对白血病、淋巴瘤有很好的效果。CAR-T疗法,实际上是利用自身免疫细胞,经体外基因改造后重新注射回体内,并利用这种强化过的免疫细胞击杀肿瘤细胞。这一疗法主要用于血液系统肿瘤,具有精准靶向、杀伤性和活跃性持久的特点,也被称为“定向巡航生物导弹”。宾夕法尼亚大学研发CAR-T治疗法团队的负责人卡尔博士将这种改造后的T细胞称为“连环杀手”——仅仅一个改造后的T细胞就可以杀死10万个癌细胞。2017年,伴随着全球首个CAR-T 疗法——Kymriah 的上市,活细胞作为一种全新的药物形式用于肿瘤治疗,预示着肿瘤免疫治疗经历百年发展终成“主角”。这种新的治疗策略的关键之处在于识别靶细胞的被称作嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor, CAR)的人工受体,而且在经过基因修饰后,病人T细胞能够表达这种CAR。在人体临床试验中,科学家们通过一种类似透析的过程提取出病人体内的一些T细胞,然后在实验室对它们进行基因修饰,将编码这种CAR的基因导入,这样这些T细胞就能够表达这种新的受体。这些经过基因修饰的T细胞在实验室进行增殖,随后将它们灌注回病人体内。这些T细胞利用它们表达的CAR受体结合到靶细胞表面上的分子,而这种结合触发一种内部信号产生,接着这种内部信号如此强效地激活这些T细胞以至于它们快速地摧毁靶细胞。

    (三)CAR-T疗法的展望

    近年来,CAR-T免疫疗法除了被用来治疗急性白血病和非霍奇金淋巴瘤之外,经改进后,也被用来治疗实体瘤、自身免疫疾病、HIV感染和移植排斥等疾病,具有更广阔的应用空间。

    1.首次利用CAR-T免疫疗法杀死被HIV感染的细胞

    在一项新的研究中,来自美国加州大学洛杉矶分校AIDS研究所和AIDS研究中心的研究人员证实最近发现的抗体能够被用来产生一种特定类型的嵌合抗原受体(CAR)T细胞(CAR-T),然后就能够利用这种CAR-T杀死被HIV-1感染的细胞。相关研究结果发表在2016年8月那期Journal of Virology期刊上,论文标题为“HIV-1-Specific Chimeric Antigen Receptors Based on Broadly Neutralizing Antibodies”。

    尽管人体的免疫系统起初确实对HIV作出反应并攻击它,但是这种对HIV的完全攻击由于这种病毒能够潜藏在不同的T细胞中和快速地复制而最终丧失殆尽,并对免疫系统造成破坏,从而让人体容易遭受一系列感染和疾病。科学家们一直在寻找增强免疫系统抵抗HIV的方法,如今,它似乎表明CAR-T就是被用来抵抗HIV的武器。

    在这项新的研究中,研究人员使用了7种最近发现的“广泛中和抗体”,这些广泛中和抗体能够结合多种入侵的HIV毒株,而不是较早前分离出的往往只结合少数HIV毒株的抗体。这些广泛中和抗体被改造为具有抵抗广泛的HIV毒株的人工CAR-T细胞受体。在实验室测试中,研究人员发现所有的这种广泛中和抗体能够不同程度地指导杀伤性T细胞增殖、杀死被HIV感染的细胞和抑制被感染的细胞中的病毒复制。

    论文通信作者、加州大学洛杉矶分校大卫-格芬医学院传染病系医学教授Otto Yang博士注意到“在试管取得的成功并不一定适用于人体中”,因此下一步就是发现将这些抗体用于人体的策略。但是这种免疫疗法有巨大的希望在进一步的研究中向前进一步推进。

    2.利用新型CAR-T免疫疗法治疗实体瘤。

    在一项新的研究中,来自美国宾夕法尼亚大学的研究人员描述了他们经过基因修饰设计出一种识别一种组合物--由一种已知的癌症相关表面蛋白和一种癌症相关糖分子组成---的CAR能够用于CAR-T免疫疗法中以便治疗一系列实体瘤。他们在胰腺癌模式小鼠体内证实了这种新的CAR-T疗法的有效性。相关研究结果于2016年6月21日在线发表在Immunity期刊上,论文标题为“Engineered CAR T Cells Targeting the Cancer-Associated Tn-Glycoform of the Membrane Mucin MUC1 Control Adenocarcinoma”。

    在这项研究中,Posey、论文共同通信作者Laura Johnson博士和来自美国芝加哥大学和丹麦哥本哈根大学的同事们构建出表达特定CAR的CAR-T细胞,其中这种CAR特异性地识别粘蛋白1(MUC1)上截断的糖分子。MUC1蛋白在正常的细胞表面上并不存在,但在很多类型的实体瘤和白血病的癌细胞表面上大量存在。

    当将这些CAR-T细胞注射回白血病或胰腺癌小鼠体内后,这些肿瘤都萎缩了,而且在大多数小鼠中被消除了,从而导致存活期增加。在接受CAR-T治疗后,胰腺癌小鼠仍然活了113天;然而,在接受不能够靶向识别具有截断的糖分子的MUC1蛋白的CAR-T治疗的小鼠当中,在这项实验结束时,仅有三分之一的小鼠存活下来。重要的是,这些经过基因修饰的CAR-T不能够伤害正常的人细胞,也不能够伤害不具有这种异常糖分子的细胞。

    这些发现提示着靶向识别在正常组织和实体瘤中发现的蛋白上存在的异常的癌症特异性糖分子可能成为一种治疗实体瘤的新免疫疗法。这种肿瘤组合识别能力可能导致人们在未来为癌症患者开发出一种安全的有效的疗法。

    3.利用表达CAR的调节性T细胞阻止移植排斥

    在一项新的研究中,来自加拿大英属哥伦比亚大学的研究人员开发出一种基因疗法,它对一类被称作调节性T细胞(T regulatory cells, Tregs)的免疫细胞进行编程,从而保护移植组织免受病人免疫系统的排斥。相关研究结果发表在2016年4月1日那期Journal of Clinical Investigation期刊上,论文标题为“Alloantigen-specific regulatory T cells generated with a chimeric antigen receptor”。 论文通信作者Megan Levings博士说,“随着进一步研究,Tregs有可能作为一种活体药物阻止移植细胞和器官免受免疫攻击。”在这项研究中,研究人员从志愿者捐献给加拿大血液服务中心的血液中分离出Tregs。他们构建出一种基因,该基因表达一种被称作HLA-A2特异性嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor, CAR)的蛋白。他们利用一种无害的病毒将这种CAR基因导入到Tregs中,从而对这些细胞进行编程,让它们识别经常在移植组织表面发现的特异性蛋白。Tregs的正常作用就是关闭免疫反应,从而阻止对健康组织产生免疫反应。他们进行一系列实验证实这些经过基因修饰的Tregs识别移植组织并且保护它们免受宿主免疫系统攻击。Levings博士说,“我们借用癌症免疫疗法中的这种方法。我们将它用于相反的目的:关闭不想要的免疫反应。”研究人员说,还需要再开展10年的研究方有可能利用基因修饰的Tregs开发出一种安全的靶向疗法。

    4.利用TanCAR-T免疫疗法实体瘤大有可为

    在一项新的研究中,来自美国贝勒医学院、德州儿童癌症中心、贝勒细胞与基因疗法中心、德州儿童医院和休斯顿卫理公会医院的研究人员发现一种基于靶向特异性表面分子的新策略能够清除胶质母细胞瘤模式小鼠体内的大多数癌细胞、阻止肿瘤逃避免疫检测、更好地控制肿瘤和改善小鼠存活。相关研究结果于2016年7月18日发表在Journal of Clinical Investigation期刊上,论文标题为“Tandem CAR T cells targeting HER2 and IL13Rα2 mitigate tumor antigen escape”。论文通信作者为贝勒医学院和德州儿童癌症中心儿科副教授Nabil Ahmed博士。

    贝勒医学院儿科助理教授Meenakshi Hegde博士想知道当利用CAR-T靶向肿瘤细胞表面上的单个抗原时,肿瘤会如何应对。CAR-T清除表面上携带靶分子的细胞,同时留下表面上未携带靶分子的细胞。当在模式小鼠体内开展这项实验时,她观察到尽管部分肿瘤被CAR-T及时地清除了,但是肿瘤还是会复发。这些复发的肿瘤细胞并不携带CAR-T识别的靶分子,相反会携带其他的表面分子。

    为此,在这项新的研究中,研究人员测试了如果他们利用CAR-T靶向两种不同的肿瘤表面分子将会发生什么。Ahmed说,他们发现“如果我们靶向不止一种抗原,那么我们有更好的机会阻止肿瘤逃避免疫检测”。

    研究人员选择的两种抗原---HER2和IL13Rα2---是抗肿瘤疗法的良好候选分子,这是因为它们在大多数胶质母细胞瘤细胞表面上表达,但是体内正常组织中非常低水平地表达。这对于让CAR-T靶向和杀死正常细胞的副作用最小化是比较重要的。

    研究人员确定了如果T细胞表面上的单个双价CAR分子能够同时结合HER2和IL13Rα2,那么将会发什么。Ahmed说,当CAR-T通过这种双价CAR分子同时识别HER2和IL13Rα2时,它的抗肿瘤“活性要比使用各自的单价CAR分子高很多”。

    CAR-T同时识别HER2和IL13Rα2的效应要高于单个识别的累加效应,即具有超加性(superadditive),其中这种同时识别HER2和IL13Rα2的CAR-T也被称作二价CAR-T。

    利用这种大分子成像技术,研究人员模拟了HER2、IL13Rα2和同时靶向这两种分子的双价CAR之间的组装。我们确定这种三组分组装在能量上是可行的。这种双价CAR很可能以串联的形式将HER2和IL13Rα2结合在一起。他们因此称它为串联CAR(Tandem CAR),或者说TanCAR。

    接下来,研究人员想要观察TanCAR T细胞(TanCAR-T)与胶质母细胞瘤细胞之间如何相互作用。利用一种分辨率在150nm以下的受激辐射耗尽(Stimulation Emission Depletion, STED)显微技术,研究人员吃惊地发现当TanCAR-T与胶质母细胞瘤细胞相互接触时,它们产生一种表面分子聚集圆盘结构,即免疫突触(immunological synapse)。一旦TanCAR与胶质母细胞瘤细胞表面上的抗原HER2和IL13Rα2结合在一起时,这会触发T细胞内部的激活,从而导致胶质母细胞瘤细胞死亡。

    5.诺华CAR-T免疫疗法CTL019治疗儿科白血病再现完美治疗潜力——完全缓解率达93%!!

    2015年第57届美国血液病学会(ASH)年会于12月5日-8日在美国奥兰多举行。近日,瑞士制药巨头诺华(Novartis)在会上公布了深受业界期待的CAR-T免疫疗法CTL019的最新临床数据。

    此次公布的是一项II期研究,调查了CTL019在复发性/难治性急性淋巴细胞白血病(r/r ALL)儿童及年轻成人患者中的疗效和安全性。数据显示,接受CTL019治疗后,完全缓解率达到了93%(n=55/59)。该研究结果进一步支持了CTL019在儿科及年轻成人r/r ALL群体中的治疗潜力。在2014年的ASH年会上,
    诺华公布了CTL019治疗39例r/r ALL儿科患者的积极顶线数据,结果显示,有36例患者经历了完全缓解(CR),比例高达92%(n=36/39)。

    该研究中,88%(n=55/59)的患者经历1-4级细胞因子释放综合征(CRS)。CTL019输注患者体内后,这种重编程的细胞被激活并在患者体内增殖,这一过程中可能引发CRS。在发生CRS时,患者通常会经历不同程度的流感样发热、恶心、肌肉疼痛,某些情况下还会出现低血压和呼吸困难。研究中,27%的患者接受了针对血流动力学和呼吸不稳定性的CRS治疗,接受IL-6受体拮抗剂后所有患者情况达到逆转。

    6、ASH 2015:诺华CAR-T免疫疗法CTL019在非霍奇金淋巴瘤再现治疗潜力

    2015年第57届美国血液病学会(ASH)年会于12月5日-8日在美国奥兰多举行。近日,瑞士制药巨头诺华(Novartis)在会上公布了CAR-T疗法CTL019一项IIa期研究的积极数据。这些数据进一步扩充了CTL019的临床证据,表明该疗法针对复发性和难治性非霍奇金淋巴瘤具有治疗潜力,目前该领域鲜有有效的治疗选择。

    此次公布的IIa期研究在复发性或难治性(r/r)非霍奇金淋巴瘤患者中开展,调查了CTL019的疗效和安全性。此次研究数据涉及可评估缓解的26例成人患者(15例DLBCL,11例FL)。结果显示,接受CTL019治疗3个月时,r/r弥漫性大B细胞淋巴癌(DLBCL)成人患者组的总缓解率为47%(n=7/15),滤泡性淋巴瘤(FL)成人患者组的总缓解率为73%(n=8/11)。在治疗3个月时实现部分缓解(PR)的DLBCL患者中,有3例在治疗6个月时转为完全缓解(CR),1例在治疗6个月时病情进展。此外,在治疗3个月时实现部分缓解(PR)的FL患者中,有3例在治疗6个月时转为完全缓解(CR),1例在治疗9个月时仍保持部分缓解(PR)但在12个月时病情进展。DLBCL患者组中位无进展生存期(PFS)为3.0个月,FL患者组中位PFS为11.9个月。

    该研究中,有4例患者发生3级或以上细胞因子释放综合征(CRS)。在发生CRS时,患者通常会经历不同程度的流感样发热、恶心、肌肉疼痛,在一些患者中还出现了低血压和呼吸困难。2例患者发生神经系统毒性,包括一例一级谵妄(神志不清)和一例可能相关的5级肝性脑病。

    7、Juno CAR-T细胞疗法JCAR015 II期临床试验被叫停事件的分析和解读


    西雅图2016年7月11日电 /美通社/ -- 美国当地时间7月7日媒体报道美国 FDA 叫停了Juno 公司的 CAR-T 疗法JCAR015 II期临床试验,该试验导致两名白血病患者因为神经毒性作用死亡。消息爆出当日Juno盘后股价暴跌30%。Juno CEO Hans Bishop 随后表示,另外一名病人在5月也因神经毒性原因死亡,公司已经在跟FDA 沟通,计划在本周向 FDA 提交相关资料,接下来几周内将获得有关被叫停试验时间表的更确切信息,同时表示该公司开发的 CAR-T 细胞疗法 JCAR017 等其他产品将不受本次试验暂停所影响。

    Juno公司以CD19为靶标的CAR-T细胞治疗产品一共有三种,包括JCAR015、JCAR017以及JCAR014。此次被叫停的是JCAR015的II期
    临床试验

    JCAR015是以CD28为共刺激结构域的第二代 CAR-T 细胞产品(以下简称CD28zCAR),所用病毒
    载体为逆转录病毒,用于治疗成人复发难治急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)和非霍奇金淋巴瘤 (NHL)。针对急性B淋巴细胞白血病 (B-ALL) 适应症已做过I期临床试验,此次被叫停的是II期临床试验。针对非霍奇金淋巴瘤 (NHL) 适应症正在做I期临床试验。JCAR015针对 B-ALL 的完全缓解率为82%。

    JCAR017是以4-1BB 为共刺激结构域的第二代 CAR-T 细胞产品(以下简称4-1BBzCAR),所用病毒
    载体为慢病毒,用于治疗儿童和成人的复发难治急性B淋巴细胞白血病 (B-ALL) 和非霍奇金淋巴瘤 (NHL) 。针对急性B淋巴细胞白血病 (B-ALL ) 适应症正在做I/II期的临床试验,针对非霍奇金淋巴瘤 (NHL) 适应症正在做I期临床试验。JCAR017的完全缓解率为91%。

    JCAR014同样也是以4-1BB为共刺激结构域的第二代CAR-T细胞产品,所用病毒
    载体也为慢病毒,与JCAR017不同的是,JCAR014使用的是CD4+和CD8+(1:1)混合的细胞群体。适应症包括复发难治成人慢性B淋巴细胞白血病 (B-ALL ) 、急性B淋巴细胞白血病 (B-ALL ) 、非霍奇金淋巴瘤 (NHL)。目前正在做I/II期的临床试验。JCAR014针对B-ALL适应症的完全缓解率为100%。

    综上所述, Juno的三个产品的共刺激结构域是不同的,JCAR015的共刺激结构域是 CD28,而 JCAR017、JCAR014的共刺激结构域是4-1BB。研究表明,CD28作为共刺激结构域,其特点是刺激CAR-T 细胞在体内迅速扩增,但同时也使得细胞迅速耗竭,因此复发率较高;4-1BB 作为共刺激结构域,刺激的CAR-T细胞在患者体内扩增相对CD28激活的CAR-T细胞较温和,但存续时间更长,因此复发率更低。这些差别已经在业内达成共识。

    8、Cancer Res:应对CAR T细胞治疗的耐药性

    Cancer Research, doi:10.1158/1538-7445.AM2015-3143
    虽然CTL019在侵袭性白血病患儿的
    临床试验中显示出了优异的治疗结果,不过,本研究报告的资深作者,宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院的病理学、实验室医学和儿科学教授,费城儿童医院实验病理科主任Andrei Thomas-Tikhonenko博士称,据估计CTL019药物在10~20%的受试者中失去了活性。


    宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院和费城儿童医院的研究团队在美国癌症研究协会杂志《癌症发现》2015年12月刊上发表的文章中表示,他们在一项研究中发现了部分B细胞白血病患儿对靶向CD19抗原的CAR T细胞疗法(CD19嵌合抗原受体T细胞疗法)产生耐药性的机制,CD19 CAR T细胞疗法是一种使许多白血病患者获得长久缓解的临床研究性免疫疗法。

    该研究报告的第一作者,Thomas-Tikhonenko实验室高级研究员,本研究项目的主力人物Elena Sotillo博士表示,Thomas-Tikhonenko的研究团队几乎早在两年前就提出了上述问题。因为从理论上来说,B细胞(即使是
    肿瘤B细胞)的生长和增殖都需要CD19蛋白,她解释说。

    为了找出CTL019的耐药机制,Sotillo和同事研究了四名白血病患儿接受CTL019治疗前和/或产生CTL019耐药后的多个
    肿瘤样本。

    “很快我们就惊喜地发现CD19基因并没有消失,它仍然存在,”她说。Sotillo及其团队发现,虽然患者体内仍有CD19蛋白生成,不过CD19蛋白已变成了不能被免疫系统识别的简化版本。

    研究人员首先在上述
    肿瘤样本中发现,位于16号染色体上CD19编码基因两个副本中的一个已被删除,而另一个基因副本因CD19基因编码区域发生突变而受损,其中第2外显子受损最为常见。然而,研究人员还了解到,在同样的情况下,通过选择性剪接,第2、5和6外显子经常会被跳读,这在很大程度上使第2外显子上的突变变得无关紧要。

    该研究团队又利用最先进的技术开展了一系列剪接实验,以理解这种基因剪接对CD19蛋白生成可能产生的影响。他们发现,缺失第5和6外显子会导致CD19蛋白的终止密码子出现过早,缺失第2外显子则会导致比原有版本更稳定的CD19蛋白突变版本的生成。

    “然后,我们进一步研究了CD19蛋白的该新同源异构体是否具有功能性,”Sotillo说。他们发现,简化版本的CD19蛋白实际上是具备功能性的,而且还可以执行原CD19蛋白执行的某些任务。 有关外显子跳读在CTL019耐药中的重要性,无论如何强调都不为过,Thomas-Tikhonenko解释说。“缺失第5和6外显子,CD19蛋白就无法被保留在B细胞表面。缺失第2外显子的情况则更为复杂。虽然没有了第2外显子的CD19蛋白可以被保留在B细胞表面(尽管不是很有效),不过它已经不能被CTL019识别了,”他说。

    Sotillo进一步解释说,虽然CD19变体(即失去第2外显子的CD19的同源异构体)对CAR T抗原受体不可见,但是它仍然能与CD19蛋白的下游效应因子正常绑定。

    对接受CTL019治疗及相似疗法的患者进行预选,并确保患者的白血病细胞不存在经过选择性剪接的CD19蛋白变体,这可能很重要,Thomas-Tikhonenko表示。

    “要想解决CTL019的耐药问题,有两种方法,”Sotillo说。“第一种方法就是,设计能够识别CD19胞外区替代抗原表位的新抗体。第二种方法就是,强迫细胞产生基因完整的CD19。实际上,这两种方法可以结合使用。”

    CTL019免疫疗法具有非常好的前景,理解该疗法未能对某些患者产生疗效及其背后的生物学机制与研发新的靶点、新蛋白和开发新疗法同样重要,Sotillo表示。

    本文部分来源自生物谷的原创编译整理,链接地址:http://www.bioon.com/tm/pandian/627790.shtml